Klon ve normal sığır embriyo plasentalarında insülin benzeri büyüme faktör-ı (IGF-I), vasküler endotelyal büyüme faktör (VEGF) ve nöronal hücre adhezyon molekül (NCAM) ekspresyonun immunositokimyasal ve moleküler tekniklerle incelenmesi

Abstract

Anadolu Yerli Sığır Irklarının Klonlanması projesi kapsamında canlı doğumla sonuçlanan klon örneklerinden elde edilen klon plasentalar ve kontrol grubu olarak da normal doğum yapmış olan sığırların plasentaları moleküler ve immunositokimyasal teknikler kullanılarak incelenmiştir. Klon sığırlarda görülen bazı anomalilerin, plasentada gerçekleşen yapısal ve moleküler bozuklukların normal plasenta ile karşılaştırılarak ilişkilendirilmesi amaçlanmıştır. Klonlama çalışmalarında Somatik Hücre Nüklear Transfer Yöntemi kullanılmıştır. Toplamda canlı doğum klon sayısı beş olmasına karşın bir taşıyıcı annenin ikiz gebelik meydana getirmesi sebebiyle toplamdaki klon plasenta örneği sayısı dörttür; iki normal plasenta da kontrol grubu olarak örneklenmiştir. Örneklenen her bölge histolojik incelemeler için %4?lük paraformaldehit içinde fikse edilmiş, moleküler yöntem için ise -20ºC `de örnekler transfer edilmiş, izolasyon aşamasına kadar ise -80ºC ?de muhafaza edilmişlerdir. Fikse edilmiş materyallerin doku takipleri gerçekleştirilmiş ve parafin bloklarda kesit alınana kadar saklanmıştır. Daha sonra mikrotom ile 5µm kalınlığında alınan kesitler öncelikle hematoksilen ? eosin boyama protokolüne göre boyanmış, temel ışık mikroskobi incelemeleri gerçekleştirilmiştir. Aynı şekilde hazırlanan kesitler daha sonra immunositokimyasal olarak IGF-I, VEGF, NCAM primer antikorları ile incelenmiştir. Örneklerden RNA izole edilmiş, kalite kontrolleri ve NanoDrop okumaları gerçekleştirilmiş, daha sonra cDNA (Fermentas) Kit kullanılarak, cDNA sentezi gerçekleştirilmiştir. InRa ve Ensembl DNA veri bankalarından IGF-I, VEGF ve NCAM primerleri ile PCR yapılmıştır. PCR ürünleri jele aktarılmış, jel görüntü sonuçları elde edilmiştir. Daha ileri analiz yapabilmek için RT-PCR işlemi, normal PCR için kullanılan primerler kullanılarak yapılmıştır. Elde edilen sonuçlar amplifikasyonlarına göre saptanmış ve istatistiki olarak analiz edilmiştir. Her iki analiz sonucunda da elde edilenlere göre, klon plasenta ve normal plasenta örnekleri arasında anlamlı bir fark bulunamamıştır.

Cloning of the Anatolian Domestic Bull project, the clone placentas derived from succesful births with live offsring; and the control group from normal birth placentas was evaluated by molecular and immunocytochemical methods. The aim of the process is to determine abnormalities, structural and functional defects of cloned placentas by comparing them to normal ones. Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) method was used in project. Despite of total birth count is five; one surrogate mother has twins so the sampled placenta count is accepted as four. The sampled areas of placenta was fixed in 4% paraformaldehyde for histological examination, and for molecular examination, the samples were transferred in -20ºC; stored in -80ºC until isolation. Fixed tissues had processed and stored in paraffin blocks until sectioning. After the process of fixation, 5 µm slides were created by slide-microtome, then all the samples were stained by standart Haematoxylin-Eosin protocol, examined by light microscopy. The same procedured samples are also examined by immunocytochemistry methods with IGF-I, VEGF and NCAM antibodies. RNA isolation was made manually by from sampled tissues. RNA was isolated and quality check-out is carried thru NanoDrop, spectrophotometer. cDNA (Fermentas) Kit is used for synthesing cDNA. Primers were desinged by the help of InRa and Ensembl DNA Banks. PCR was performed for IGF-I, VEGF and NCAM primers. For further analysis, RT-PCR process has been used with normal PCR primers. Results, that statistically analized from both immunocytochemical and molecular processes, examples of normal and the cloned placentas were no siginificant difference between them.