Sıçan duyusal sinir hücre kültürlerinde ATP-duyarlı potasyum kanallarının biyofiziksel ve farmakolojik yaklaşımlarla tanımlanması

Abstract

34 5. ÖZET Bu çalışma sıçan duyusal sinir hücre kültürlerinde ATP duyarlı K+ (K(ATP)) kanallarının biyofiziksel ve farmakolojik yaklaşımlarla tanımlanması amacıyla planlandı. Çalışmada Wistar-Albino cinsi sıçanların iki günlük yavruları kullanıldı. Dekapitasyönla öldürülen sıçanların dorsal kök gangliyon (DKG) hücreleri (n=5) mekanik ve enzimsel işlemlerle tek olarak ayrılıp, yüzeyi laminin-polyomithine ile kaplı lameller üzerine ekilip, daha sonra kayıt alınması işleminde kullanılmak üzere 37°C'de %5 CO2 içeren nemli inkübatörde saklandı. İnkübatörden alınan kültüre DKG hücreleri kayda başlanmadan yaklaşık olarak 5 dakika önce üç defa ekstrasellüler kayıt solüsyonuyla yıkandı. Tüm hücre diyaliz modunun gerçekleştirilmesinden sonra, akım kenetleme deneylerinde istirahat membran poptansiyeli ölçüldü ve akım enjeksiyonuyla membran potansiyeli istenilen membran potansiyelinde tutuldu. Voltaj kenetleme deneylerinde ise membran voltajı -70mV'ta kenetlenerek akımlar bu potansiyelden aktive edildi. Kontrol koşulları ve glikoz-free ekstrasellüler kayıt solüsyonu kullanılarak yapılan deneylerde; ortalama membran potansiyelleri, aksiyon potansiyelleri ortalama eşik değerleri, ortalama aksiyon potansiyeli süresi ve aksiyon potansiyeli aktivasyonu için gerekli ortalama depolarizasyon değerlerinde gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı farkların olduğu belirlendi (tüm gruplarda, p<0,05). Akım kenetleme deneylerinde, glikoz-free ekstrasellüler kayıt solüsyonu uygulamasına bağlı olarak membran hiperpolarizasyonu gözlendi. K(ATP) kanal aktivatörü diazoksid (100aM) uygulanması da benzer şekilde bir membran hiperpolarizasyonu oluşturdu (ortalama -23±3.2 mV'luk). Glibenklamid (20iM) uygulanmasının meydana gelen bu membran hiperpolarizasyonlarını tamamen inhibe ettiği belirlendi. Voltaj kenetleme deneylerinde hücrelere uygulanan diazoksid (100jaM) dışa yönelik membran akımlarını aktive etti. Bu aktivasyon glibenklamid (20J//I) uygulanmasıyla inhibe edildi (n=6). Sonuç olarak, bu çalışma sıçan DKG hücrelerinde K(ATP) kanallarının mevcut olduğuna bir delil teşkil etmekte; iskemi, metabolik stres ve ağrı duyusunun iletilmesinin inhibisyonunda da fonksiyonel bir öneme sahip olabileceğini düşündürmektedir.

35 6. SUMMARY This study was carried out to identify ATP sensitive K+ (K(ATP)) channels with pharmacological and biophysical approaches in cultured rat sensory neurons. Neonatal (2 day old) Albino Wistar rats were used in this study. Dorsal root ganglia (DRG) were removed after decapitation and DRG neurones were isolated by enzymatic and mechanical procedures. They were placed on iaminin- polyornithine-covered coverslip and kept in a humid incubator (5 %C02) at 37°C before use for electrophysiological recording. DRG were washed three times with extracellular recording solution before the electrophysiological recording. In current-clamp experiments, after establishing whole-cell mode of the patch clamp technique, resting membrane potentials were recorded and it was kep at a stable membrane potential by current injention method. Membrane voltage was clamped at -70mV and currents were recorde in voltage-clamp experiments. In the control experiments where glucose-free extracellular recording solution was used, there were statistically significant differences between mean membrane potentials, mean action potential thresholds, mean action potential duration and mean depolarisation values for induction of an action potential (p<0.05 in all groups). Membrane hyperpolarisation was observed depending on the application of glucose-free extracellular recording solution in the current-clamp experiments. Application of a K(ATP) channel activator, diazoxide (100(.iM) induced a membrane hyperpolarsation (mean -23±3.2 mV) in a similar manner. Glibenclamide (20jj,M) completely negated this membrane hyperpolarisation. Diazoxide (IOO41M) activated outward membrane currents in the cells used in the voltage-clamp study. This activation was inhibited by application of glibenclamide (20(iM, n=6). In conclusion, these results provide evidence for the presence of K(ATP) channels in DRG cells. It is thought that they may be functionally important in ischemia, metabolic stress and inhibition of pain impulses.