Bruselloza karşı endemı̇k Brucella Abortus`tan rekombı̇nant OMP25 proteı̇nı̇ eldesı̇

Abstract

Bruselloz; insanlarda sayısız organı etkileyerek spesifik ve/veya spesifik olmayan belirtilerle hastalık yapan, laboratuvardan kaynaklı bakteriyal enfeksiyon ajanı olarak son yıllarda insidansı yükselen, hayvanlarda sıklıkla yavru atımı (düşükler) ve süt veriminin azalması gibi faktörlerden dolayı ciddi ekonomik kayıplara sebebiyet veren, ayrıca biyoterörizm saldırılarında kullanılan zoonotik bir hastalıktır. Bu hastalıktan korunmak için; insanlarda uygulanabilecek herhangi bir aşının geliştirilmemiş olması, hayvanlarda ise kulllanılan aşıların virulansı azaltılmış canlı aşı olması sebebiyle yeni teknolojik yaklaşımlarla etkin aşıların geliştirilmesine ihtiyaç duyulmaktadır.Bu amaçla sunulan tez çalışmasında Brucella abortus straininin dış membranında yer alan immunojenik özellikteki dış membran proteini Omp25'in, rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak eldesi gerçekleştirilmiştir. Çalışmada, öncellikle Erzurum İl Gıda Tarım ve Hayvancılık Müdürlüğü'nden temin edilen endemik B. abortus tip 3 straininin Omp25 gen bölgesi uygun primerlerle amplifiye edildikten sonra pET102/D- TOPO plazmitine klonlanmıştır. DNA sekans analizi vektörün başarılı bir şekilde oluşturulduğunu doğrulamıştır. Ayrıca, yapılan filogenetik analiz, ilgili genin diğer Brucella suşları ile yakın bir genetik ilişkiye sahip olduğunu göstermiştir. Omp25 genini taşıyan plazmitler, E.coli BL21 (DE3) strainine tranforme edilerek ekspresyon gerçekleştirilmiştir. Total protein içeriğinden rOmp25 proteini Ni‐NTA afinite kromatografisi yöntemi ile denatüre koşullarda saflaştırılmıştır. Saf olarak elde edilen son üründeki toplam protein konsantrasyonu BCA metodu ile 0,50 mg/mL olarak hesaplanmıştır. Tüm bu aşamalarda gerekli doğrulamalar yapılmış ve son ürün ticari olarak satın alınan rOmp25 ile karşılaştırılmıştır.

Brucellosis is a zoonotic disease that affects numerous organs in humans and causes disease with specific and/or nonspecific symptoms, has increasing incidence recently as an bacterial infection agent originating from laboratory, causes serious economical losses due to factors such as miscarriages and the decrease in milk yield in animals, and moreover used in bioterrorism attacks. To prevent this disease, it is needed to develop effective vaccines with new technological approaches because of the lack of any vaccine that can be applied in humans and the vaccine used in animals is live vaccine with decreased virulence.In this thesis, the immunogenic outer membrane protein Omp25, which is located in the outer membrane of Brucella abortus strain, was obtained by using recombinant DNA technology. In the study, the Omp25 gene region of the endemic Brucella abortus type 3 strain provided by Erzurum Provincial Directorate of Food, Agriculture and Livestock was amplified with suitable primers and then cloned into the pET102 / D-TOPO plasmid. DNA sequencing analysis confirmed that the vector was successfully establised. Also, phylogenic analysis showed the gene of interest has a near genetic relation with other Brucella strains. The plasmids carrying the Omp25 gene were transformed into E.coli BL21 (DE3) strain and expression was performed. rOmp25 protein was purified from total protein contents by Ni-NTA affinity chromatography method in denaturing conditions. The total protein concentration of the final pure product was calculated as 0.50 mg/mL with BCA method. The necessary validations were made at all these stages and the final product was compared with the commercially purchased rOmp25.