Analysis of HMLHI germline mutations in three Turkish hereditary nonpolyposis colorectal cancer kindreds

Abstract

Kalıtsal polipoz olmayan kolorektal kanseri, Batı ülkelerinde en sık rastlanan genetik hastalıklardan biridir. Bu klinik sendrom, erken yaşta ortaya çıkan kolorektal kanseri ve diğer kanserlerin ortaya çıkmasını artıran kalıtsal yatkınlıkla karakterizedir. Beş, insan yanlış eşleşme DNA tamir genlerinden (hMLHl, hMSH2, hPMSl, hPMS2, ve hMSH6) birinde olan eşey hücresi bozukluğu, bu hastalığın ortaya çıkmasına neden olur. Kalıtsal polipoz olmayan kolorektal kanserli ailelerde bulunan mutasyonlann çoğunluğu, hMLHl ve hMSH2 genlerinde görülmektedir. Bu çalışmada, kalıtsal polipoz olmayan kolorektal kanserli üç Türk ailesinde bulunan eşey hücresi mutasyonlannm tanımlanması için çeşitli mutasyon tarama metodlan kullanılmıştır. Genomik DNA'nın restriksiyon enzim analizi, daha önceden tanımlanmış G884C mutasyonu taşıyan bir kalıtsal polipoz olmayan kolorektal kanserli ailenin beş ferdinin incelenmesinde kullanılmıştır. Bu beş bireyin genotipleri, Ddel enzim analizi ile belirlenmiş ve sonuçlar DNA dizi analizi ile doğrulanmıştır. Daha önceden tanımlanmış A1652C mutasyonunu taşıyan diğer bir kalıtsal polipoz olmayan kolorektal kanserli ailenin yirmidokuz ferdi, Hphl restriksiyon enzim analizi ile tanımlanmıştır ve sonuçlar DNA dizi analizi ile doğrulanmıştır. Her iki analiz de genetik danışma isteyen bu ailelerin mutasyon taramasında, güvenilir ve hesaplı tekniklerdir. Tek iplikçikli yapısal çeşitlilik analizi, bilinmeyen eşey hücresi mutasyonlannın taranmasında kullanılmıştır. En hassas protokollerin belirlenmesi için, daha önceden mutasyonlan tanımlanmış dokuz DNA örneği, çeşitli jel içeriği ve elektroforez koşullarında çalışılmıştır. Bu protokoller, daha sonra rutin mutasyon tarama çalışmalarında kullanılmıştır. Mutasyonu henüz tanımlanmamış olan üçüncü bir kalıtsal polipoz olmayan kolorektal kanserli ailenin, hMLHl geninin bütün kodlayıcı dizisi, bu metodla taranmıştır. Ekson 7 ve 15, kontrol diziye göre farklılık göstermiştir. Bu iki eksonun nükleotid dizileri, floresan otomatik DNA analizi ile belirlenmiştir. Ekson 15 deki farklılığın, kontrol örnekteki intronik bir polimorfizimden kaynaklandığı görülmektedir. Ekson 7 için ilk veriler, probanla kontrol nükleotid sekans arasında bir farkhlık olmadığını göstermektedir. Sonuç olarak, bu ailedeki yanlış eşleşme DNA tamir bozukluğunun hMLHl geninden kaynaklanmadığı düşünülmektedir. İleriki çalışmalar, hMSH2 geninin incelenmesi üzerinde yoğunlaşacaktır. iv

Hereditary nonpolyposis colorectal cancer (HNPCC) is one of the most common genetic diseases in Western world. It is a clinical syndrome characterized by an inherited predisposition to early onset colorectal and an increased incidence of other cancers. The disease is caused by a germline defect in one of five human DNA mismatch repair genes, hMLHl, hMSH2, hPMSl, hPMS2, and hMSH6. Defects in hMLHl and hMSH2 account for the majority of mutations found in HNPCC families. In this study, a variety of mutation detection methods were used to identify hMLHl germline mutations in three Turkish HNPCC kindreds. Restriction enzyme analysis of genomic DNA was used to analyze five members of an HNPCC family with a previously described G884C mutation. The genotypes of all five individuals were determined by Ddel digestion and the results were confirmed by DNA sequence analysis. HphI restriction enzyme analysis was used to analyze twenty-nine members of an unrelated HNPCC family for a previously identified A1652C mutation. Genotypes were determined for all individuals and the results were confirmed by DNA sequence analysis. Both of these restriction enzyme analyses are reliable, cost-effective methods that can be used in mutation screening programs for family members who request genetic counseling. Single strand conformation polymorphism analysis (SSCP) was used to screen for unknown germline mutations. Nine DNA samples with defined mutations in the hMLHl gene were analyzed using several gel formulations and electrophoretic conditions to determine the most sensitive protocols. These protocols were then used for routine mutation detection. In a third HNPCC family, for whom no mutation has yet been defined, the complete coding sequence of the hMLHl gene was screened by SSCP. Two exons, 7 and 15, showed an altered mobility compared to control sequences. The nucleotide sequence of these two exons was determined by automated fluorescence DNA sequence analysis. The differential mobility observed for exon 15 appears to be due to an intonic polymorphism in the control sample. Preliminary results for exon 7 show no difference between proband and control nucleotide sequences. Thus, the DNA mismatch repair defect in this kindred appears not to be in hMLHl. Further studies will focus on the analysis of hMSH2. iii