Candida albicans genetiği ile ilgili olarak DNA izolasyonu, DNA transformasyonu ve beyaz-opak koloni değişimi

Abstract

-47 VI-ÖZET Bu çalışmada ülkemizde gittikçe önem kazanan mantar enfeksiyonlarının etkenleri arasında birinci sırada yer alan Candida albicans' in patojenite özellikleri, DNA ile ilişkili olarak, saprofit bir Candida susuna aktarılmış ve genotipte meydana getirilen mutasyonun fenotipteki etkisi gözlenmiştir. Klasik yöntemlerle tiplendirilen maya kolonilerinden C. albicans olan ve C. albicans olmayan suşlarla, standart olarak Saccharomyces cerevisiae'nın DNA izolasyonları yapılmıştır. S.cerevisiae ve C. albicans suşlarının 2,2 Mb, 1,6 Mb ve 1,2 Mb noktalarında aynı yerlerde DNA bantları oluşturduğu,saprofit Candida susunun ise 2,2 Mb noktasının üzerinde bir yerde tek bir DNA bantı oluşturduğu saptanmıştır. İzole edilen C. albicans DNA'smdan 0.1 cc, saprofit Candida susundan 0.9 cc (2.0x1 08 ml/hücre) alınarak, YEPD besiyeri içerisinde, 37°C'de çalkalayıcın su banyosunda 24 saat karıştırılmıştır. DNA transformasyon sonucunu gözlemek için besiyerleri ve deney hayvanları kullanılmıştır. Sabouroud agar besiy erinde üreyen transformantların jerm tüp yapımına ve Mısır- unu+Tween 80 besiyerinde de klamidospor yapımına bakılmıştır. 7 deney hayvanına inokule edilen transformantlar sadece 2 deney hayvanında hastalık oluşturmuştur. Candida' larda virulans faktörlerinden biri olan beyaz-opak koloni dönüşümünü gösteren C. albicans WO-1 susunun kimyasal yöntemler ile DNA' sı izole edilmiştir. DNA bantlarının 2,2 Mb, 1,6 Mb ve 1,2 Mb noktalarında ortaya çıktığı saptanmıştır. İzole edilen WO-1 susunun DNA'sından 0.1 cc,saprofit Candida susundan 0.9 cc (2.0x108 hücre/ml) alınarak, YEPD besiyeri içerisinde,37 OC'de çalkalayıcın su banyosunda 24 saat kanştırılmıştır. Oluşan transformantlar Sabouroud agar besiyerinde üretilerek,kolonileri makroskopik olarak incelenmiştir. Transformantların hepsinin beyaz renkli,yuvarlak,düzgün yüzeyli koloni morfolojisi yani beyaz fenotip özelliği taşıdığı saptanmıştır. DNA transformasyon işleminden sonra 254 nm dalga boyunda UV ışığı kullanılarak,transformantlarda mutasyon meydana getirilmiştir. Kalın duvarlı,geniş yüzeyli,beyaz fenotipe göre daha büyük,çok çekirdekli,granül ile dolu vakuoller içeren hücrelerin geliştiği elektron mikroskobu ile gösterilmiştir. Mutasyon sonucunda beyaz hücre morfolojisinden opak hücre morfolojisine dönüşüm meydana gelmiştir. Çalışmamızın sonuçlan Candida'larda hastalık oluşturma mekanizmalarının ve virulansı arttıran bazı özelliklerin DNA'ya bağlı olduğunu göstermiştir.-48 VII-SUMMARY In this study; Candida albicans which is the most isolated agent of the fungal infections and it's criterias of pathogenicity, genotypic mutations efficiency on phenotype and all these specialities interactions with DNA, have been investigated. Further than all of them have been transferred to saprophyte strain and observed. C. albicans and saprophyte Candida colonies isolated with classical methods. DNA of these strains and DNA of Saccharomyces cerevisiae as control have been extracted by chemical procedures. S.cerevisiae and C. albicans strain's bands formed on the same place (2,2Mb, 1,6Mb, 1,2Mb). Saprophyte strain's band (only one band over the 2,2Mb) formed on the different place. Isolated C.albicans's DNA (0,1 cc) and saprophytes strain's (0,9cc - 2,0x1 08 cell/ml) treated for transformation on YEPD medium. Colonies from YEPD medium inoculated to Sabouroud dextrose agar for germ tube formation and cornmeal agar for chlamydiaspor formation. Transformant colonies inoculated to seven experiments animals; and only two of them infected with Candida. C. albicans WO-1 strain's DNA that shows transitions of white-opaque colony, which is a virulence factor; isolated with chemical procedures. It's DNA bands formed on 2,2Mb, 1,6Mb and 1,2Mb place. Transformation has been repeated on YEPD medium and inoculated to Sabouroud dextrose agar for macroscopic specialities. All these transformant colonies were white, hemispherical and smooth, like white phenotype. Mutation is formed in transformant white colonies by using mutagene (UV-254nm). After UV radiation white cells transformed to opaque cells which presented thick cell walls, contained large vacuoles full with granules, and exhibited roughly twice the volume. Results of our study determinate that mechanisms of Candida infection and factors that increasing virulance are related to DNA.

-48 VII-SUMMARY In this study; Candida albicans which is the most isolated agent of the fungal infections and it's criterias of pathogenicity, genotypic mutations efficiency on phenotype and all these specialities interactions with DNA, have been investigated. Further than all of them have been transferred to saprophyte strain and observed. C. albicans and saprophyte Candida colonies isolated with classical methods. DNA of these strains and DNA of Saccharomyces cerevisiae as control have been extracted by chemical procedures. S.cerevisiae and C. albicans strain's bands formed on the same place (2,2Mb, 1,6Mb, 1,2Mb). Saprophyte strain's band (only one band over the 2,2Mb) formed on the different place. Isolated C.albicans's DNA (0,1 cc) and saprophytes strain's (0,9cc - 2,0x1 08 cell/ml) treated for transformation on YEPD medium. Colonies from YEPD medium inoculated to Sabouroud dextrose agar for germ tube formation and cornmeal agar for chlamydiaspor formation. Transformant colonies inoculated to seven experiments animals; and only two of them infected with Candida. C. albicans WO-1 strain's DNA that shows transitions of white-opaque colony, which is a virulence factor; isolated with chemical procedures. It's DNA bands formed on 2,2Mb, 1,6Mb and 1,2Mb place. Transformation has been repeated on YEPD medium and inoculated to Sabouroud dextrose agar for macroscopic specialities. All these transformant colonies were white, hemispherical and smooth, like white phenotype. Mutation is formed in transformant white colonies by using mutagene (UV-254nm). After UV radiation white cells transformed to opaque cells which presented thick cell walls, contained large vacuoles full with granules, and exhibited roughly twice the volume. Results of our study determinate that mechanisms of Candida infection and factors that increasing virulance are related to DNA.