Use of tissue transglutaminase ( variant 2 )-transduced mesenchymal stem cells in cartilage tissue engineering

Abstract

Gelişmekte olan teknolojinin yan etkilerinden doğan obezite gibi hastalıklar yüzünden oluşan ciddi eklem kıkırdağı hasarları her geçen gün bireyler arasında artış göstermektedir. Kıkırdak dokusu, kan damarları ihtiva etmemesinden dolayı, kendi kendini yenileyememekte ve bu sebeple doku hasarlarının tedavisinde kıkırdak doku mühendisliğinin önemi gittikçe artmaktadır. Bu çalışmada, doku-transglutaminaz (varyant 2) ile transdüklenmiş sıçan kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücreleri (sKİMKH) kullanılarak kıkırdak doku yenilenmesi amaçlanmıştır. Bunun için hücreler doku-transglutaminaz-varyant 2 (TGM2_v2) geni ile transdüklendikten sonra, poli(bütilen süksinat) (PBSu) ve poli-L-laktit (PLLA) karışımı iskeleler üzerinde büyütülüp, farklılaştırılmıştır. Oluşan yapılar taramalı elektron mikroskobu ve MTS analizi ile sırasıyla topografik ve hücre canlılığı bakımından karakterize edilmiş ve ardından üç hafta boyunca kondrojenik farklılaşma testlerine tabi tutulmuşlardır. Kondrojenik matriks depolanmasını gözlemlemek için Alsiyan mavisi boyaması ve immünboyama; kıkırdağa özgü genlerin ifadesini incelemek içinse eş zamanlı-polimeraz zincir reaksiyonu yapılmıştır. Sonuç olarak, transdüklenmiş hücrelerin TGM2_v2'yi hem gen hem protein düzeyinde başarılı bir şekilde ifade ettikleri ve iskeleler üzerinde depolayabildikleri gözlenmiştir. Bu hücreler aynı zamanda kıkırdağa özgü proteinleri, herhangi bir kondrojenik indüksiyon olmadan kendiliğinden üretebilmişlerdir. Benzer bir şekilde, eş zamanlı-polimeraz zincir reaksiyonu sonucunda TGM2_v2 transdüksiyonunun hücrelere kendiliğinden kıkırdağa farklılaşma potansiyeli sağladığı görülmüştür. Özetle, TGM2_v2 ile transdüklenmiş sKİMKHler ve PBSu:PLLA ile oluşturulmuş olan bu yapı, gelecekte yapılacak olan kıkırdak doku mühendisliği çalışmalarında kullanmak üzere göz önünde bulundurulmalıdır.

Articular cartilage defects are increasing among the individuals because of the side-effects of the developing technology, such as obesity that causes serious joint degeneration. Since cartilage is incapable of self-healing upon severe degeneration due to the lack of blood vessels, cartilage tissue engineering is gaining importance in the treatment of cartilage defects. This study was designed to improve cartilage tissue regeneration by expressing tissue transglutaminase variant 2 (TGM2_v2) in mesenchymal stem cells (MSC) derived from bone marrow of rats (rBMSCs). For this purpose, MSCs transduced with TGM2_v2 were grown and differentiated on three-dimensional poly(butylene succinate) (PBSu) and poly-L-lactide (PLLA) blend scaffolds. The constructs were characterized by scanning electron microscopy and MTS assay for the topographical analysis and cell viability, respectively. Chondrogenic differentiation analyses were performed throughout 3 weeks. Alcian Blue staining and immunofluorescence assay were carried out to observe the chondrogenic matrix deposition, while real-time PCR was performed to examine the expression levels of cartilage specific genes. It was demonstrated that the transduced cells could not only successfully express the short form TG2 (TG2-S), but also deposited the protein onto the scaffolds. In addition, they could spontaneously produce cartilage specific proteins without any chondrogenic induction, as shown by Alcian Blue staining and collagen type 2 and aggrecan immunofluorescence. Similarly, real-time PCR results suggested that TGM2_v2 expression provided the cells the ability of chondrogenic differentiation without addition of any differentiation factors. In conclusion, the TGM2_v2 gene transfer to MSCs could be taken into consideration in the future cartilage tissue engineering applications using PBSu:PLLA scaffolds.