Yeni sigma-1 reseptör antagonisti s1ra (E-52862)`nın ve rimkazol`ün U87MG glioblastoma hücrelerinde sfingosin kinaz sinyal yolağı üzerinden antikanser etkisinin araştırılması

Abstract

Kemoterapötik tedavinin zor olduğu beyin tümörleri arasında yüksek mortalitesi ve heterojenitesi sebebiyle glioblastoma multiforme önemli bir grubu oluşturmaktadır. Bu tez çalışmasında, yeni selektif sigma-1 reseptör antagonisti S1RA (E-52862) ile non- selektif sigma reseptör antagonisti rimkazolün U87MG glioblastoma hücrelerinde antikanser etkileri karşılaştırılmalı olarak çalışılmış ve özellikle apoptotik etkide sfingosin kinaz yolağının etkili olup olmadığı araştırılmıştır. Antiproliferatif ve apoptotik etkiler sırasıyla MTT, koloni formasyonu, RT-CA DP, Annexin/PI ve kaspaz-3 aktivasyon yöntemi ile, hücre içi sitozolik Ca+2 düzeyi de Fluo-3 akım sitometride çalışılmıştır. S1RA ve rimkazolün, sfingosin kinaz mRNA ekspresyonları üzerindeki etkileri de RT-PCR analizi ile araştırılmıştır.Sonuç olarak, S1RA ve rimkazolün U87MG hücrelerinde, 24. saatte antiproliferatif ve apoptotik etkileri konsantrasyon artışına bağlı olarak artmış, koloni formasyonu ise konsantrasyon arttıkça inhibe olmuştur. S1RA'ya ait geç apoptotik ve rimkazole ait erken apoptotik hücre oranlarının daha yüksek olduğu görülmüştür. S1RA'nın hücrelerde belirgin bir kaspaz-3 aktivasyonu yaptığı belirlenmiştir. S1RA ve rimkazolün IC25 konsantrasyonlarında, sitozolik kalsiyumun artmış olduğu görülmüştür. Özellikle S1RA'nın IC50 konsantrasyonunda apoptotik etkiye paralel olarak, sfingosin kinaz-1 ve sfingosin kinaz-2 mRNA ekspresyonları azalmıştır. Bu çalışma ile sigma reseptör antagonistlerinin glioblastomada antikanser etkilerinin belirlenmiş olması, kemoterapide yeni etki mekanizmalarına ve yeni etkili bileşiklerin araştırılmasına ışık tutacaktır.

Brain tumors are one of the dangerous and non-responsive solid tumours due to high invasiveness in the body. The aim of the study was to investigate the anticancer and antiproliferative effects of new selective sigma-1 receptor antagonist S1RA and sigma receptor antagonist rimcazole in a way as carring out followings; MTT and RT-CA DP assays, caspase-3 activation, Fluo-3 and Annexin/PI staining assays in flow cytometry and colony formation assay on Glioblastoma Multiforme cells (U87MG) that are highly metastatic, heterogenous and mortal. In addition to other assays mentioned above, RT-PCR (Real time polimerase chain reaction) measurements were carried out to evaluate the effects of S1RA ve rimcazole on sphingosine kinase pathway.According to the results, S1RA and rimkazol both caused antiproliferative and apoptotic effects at 24th hour in depending increasing concentrations that gave rise to inhibition of colony formation. S1RA was found more effective in % late apoptotic cell percentages whereas rimcazole was found more effective in early apoptotic cell percentages. S1RA caused significant caspase-3 activation in comparing with rimcazole. Both drugs' IC25 values have been shown to cause apparent increasing at intracellular cytosolic calcium levels. As to RT-PCR results, given the apoptotic effects, S1RA's IC50 concentration particularly caused downregulation on the target/reference ratios of mRNA expression of sphingosine kinase-1 and -2. In relation with carrying out this study, the evaluation of sigma receptor antagonists on glioblastoma will lead to new indicative pathways and new effective drugs in chemotherapy.