Domates bakteriyel kanser etmeni Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis ve domates bakteriyel yaprak lekesi etmeni Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria` nın LNA probe`a dayalı real time PCR ile tanısı ve saptanması

Abstract

Bu çalışmada, Domates Bakteriyel Solgunluk ve Kanser hastalık etmeni Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm) ve Domates ve Biber Bakteriyel Yaprak Lekesi hastalık etmeni Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria (Xav)' nin Real-Time PCR ile tanısı ve Real-Time Bio-PCR ile tohumdan ve hastalıklı bitki dokulardan tespitini gerçekleştirmek için hassas ve seçici bir Real-Time PCR yöntemi geliştirilmiştir.Geliştirilen Real-Time PCR yöntemine uygun yeni primer ve probe setinin hassasiyeti farklı Cmm ve Xav strainlerine, farklı cins ve türe ait bitki patojeni bakterilere ve domates ve biber genomik DNA' sına karşı test edilmiştir. 73 bp' lik PCR ürünü tüm Cmm strainlerinden, 69 bp'lik PCR ürünü ise tüm Xav strainlerinden çoğaltılabilirken, Cmm ve Xav olmayan diğer bakteri strainlerinden ve domates ile biber genomik DNA' sından çoğaltılamamıştır. Geliştirilen TaqMan Real-Time PCR yönteminin Cmm ve Xav için direkt bakteriyel süspansiyondan tespitindeki hassasiyet limitleri sırası ile 1 cfu/ml ve 2 cfu/ml , saf genomik DNA' dan ise her iki patojen için 10 pg olarak bulunmuştur. Real-Time PCR yönteminin Cmm ve Xav' nin tohumdan tespitindeki hassasiyet limitleri ise sırası ile 1 cfu/ml ve 2 cfu/ml olarak bulunmuştur. Cmm ve Xav' nin içsel dizi kontrolünün sağlanması için LNA probu kullanılarak geliştirilen bu Real-Time PCR yöntemi seçici hassas ve tekrarlanabilir bir yöntemdir. Bu yöntem Cmm ve Xav' nin hastalıklı bitki dokularından ve tohumlardan hızlı ve hassas bir şekilde tanısında ve tespitinde yaygın olarak kullanılabilecektir.ANAHTAR KELİMELER: Domates, Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm), Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria (Xav), RealTime PCR (RT-PCR), Real-Time Bio-PCR, Tespit, Tanı

In this study, a sensitive and selective Real-Time PCR method was developed for identification and detection of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm) causal agent of Tomato Bacterial Canker and Wilting Disease and Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria (Xav) causal agent of Bacterial Leaf Spot Disease of tomato and peppers.The sensitivity of primer and prob sets developed in this study were tested against different Cmm and Xav strains, plant pathogenic bacteria from different genus and species, tomato and pepper total genomic DNA. Although 73 bp and 69 bp DNA fragments were amplified from all Cmm and Xav strains, respectively, no amplified product was obtained from bacterial genus and species except Cmm and Xav, and tomato genomic DNA. The detection limits of Real-Time PCR were found to be 1 cfu/ml and 2 cfu/ml from seeds, 1 cfu/ml and 2 cfu/ml from direct bacterial cell and 10 pg DNA from purified genomic DNA, for Cmm and Xav, respectively. This Real-Time method developed by using LNA probe providing internal control of the sequence is selective, sensitive and repeatable.This method can be used for rapid and sensitive identification of Cmm and Xav strains from direct bacterial cell and detection of Cmm and Xav strains from seed and diseased plant tissues.KEY WORDS : Tomato, Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm),Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria (Xav), Real-Time PCR (RT-PCR),Real-Time Bio-PCR,Diagnosis, Detection