Oküler yüzey rekonstrüksiyonunda kullanılmak üzere insan kaynaklı fibrin kaplama varlığında limbal eksplant kültür

Abstract

Sunulan tez çalışması kapsamında tamamen insan kaynaklı hücre kültürü biyomalzemeleri kullanılarak korneal limbal eksplant kültür ile limbal epitel kök hücreler (LEKH) in elde eldilmesi amaçlanmıştır. Tez çalışmasının ilk aşamasında limbal eksplantların yerleştirileceği ve hücre migrasyonunu destekleyecek kültür yüzeyleri oluşturulmuştur. Bu amaçla literatürde sıklıkla kullanılmakta olan insan kaynaklı amniyotik membran (AM) (donmuş-çözdürülmüş-de-epitelize edilmiş) ve çalışmanın özgün noktası olarak insan kaynaklı trombositten zengin fibrin (TZF) (1,000 rpm 5 dk) kullanılmıştır. Hazırlanan yüzeyler faz kontrast mikroskobu (FKM) ve tarayıcı elektron mikroskobu ile incelendiğinde, AM yüzeyin TZF yüzeye göre daha sıkı konumlanmış fiberlerden oluştuğu gözlemlenmiştir. Daha sonra insan kaynaklı AM (taze) ve standart protokol (2,700 rpm 12 dk) ile hazırlanan TZF'nin 14 günlük inkübasyonu ile hazırlanan modifiye besi ortamları in vitro hücre kültürü çalışmaları süresince kullanılmıştır. Besi ortamı ve kültür yüzeyi hazırlamakta kullanılan tüm biyomateryallerin salım kinetikleri in vitro salım çalışmaları ile değerlendirildiğinde epidermal büyüme faktörü (EGF) ve transforme edici büyüme faktörü-β (TGF-β) için en yüksek konsantrasyona sahip biyomateryalin 2,700 rpm 12 dk protokolü ile hazırlanmış TZF; vasküler endotel büyüme faktörü-A (VEGF-A) için en yüksek konsantrasyona sahip biyomateryalin ise taze AM olduğu görülmüştür. Karakterizasyon çalışmaları tamamlandıktan sonra 4 farklı grup oluşturularak hücre kültürü çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Grup 1'de AM yüzey kaplama ve standart besi ortamı, Grup 2'de AM yüzey kaplama ve AM ile modifiye edilmiş besi ortamı, Grup 3'te TZF yüzey kaplama ve standart besi ortamı, Grup 4'te TZF yüzey kaplama ve TZF ile modifiye edilmiş besi ortamı kullanılmıştır. Demografik açıdan istatistiksel bir fark arz etmeyen 32 adet donör kornea-skleral rim gruplara rastgele dağıtılarak 14 günlük hücre kültürü çalışması gerçekleştirilmiştir. Kültür süresince migrasyona uğrayan hücrelerin morfolojisi FKM ve canlı hücre görüntüleme sistemleri ile takip edilmiştir. On dördüncü gün sonunda hücre iskeleti/çekirdek boyamaları ile hücrelerin morfolojisi, canlı/ölü boyamaları ile hücrelerin canlılıkları, immünsitokimyasal boyamalar ile belirlenen belirteçler bakımından hücrelerin köklülüğü değerlendirilmiş ve gruplar arasında karşılaştırmalar yapılmıştır. Ayrıca akış sitometre analizi ile belirteçlerin ifade yüzdeleri hesaplanarak gruplar arasında kantitatif karşılaştırmalar yapılmıştır. Son olarak, gen ifade seviyelerini belirlemek amacıyla gerçek zamanlı ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) analizi gerçekleştirilmiştir. Semi-kantitatif olarak yorumlanan boyama sonuçları ve kantitatif olarak değerlendirilen akış sitometre ve RT-PCR sonuçları, TZF ile kaplanan yüzeylerde TZF ile modifiye edilmiş besi ortamı ile beslenen hücrelerin morfolojik ve kök hücre belirteçleri açısından daha çok LEKH lehine çıktığını göstermiştir. Elde edilen veriler, bu tez çalışmasında özgün olarak kurgulanmış insan kaynaklı fibrin kaplamanın limbal eksplant kültürde LEKH migrasyonunu köklülüğü koruyacak şekilde uyardığını göstermiştir. Bu sonuçlar, LEKH kültüründe literatürde sıklıkla kullanılan ancak sahip olduğu dezavantajları sebebiyle alternatifleri aranan standart yöntemlere üstünlüğü olan ve tamamen insan kaynaklı ürünlerden oluşan yeni bir hücre kültür sisteminin önemini vurgulamaktadır.

Within the scope of the presented thesis study, it was aimed to obtain limbal epithelial stem cell (LESC) by conducting corneal limbal explant culture using completely human-derived cell culture biomaterials. At the first stage of the thesis study, culture surfaces were created to place limbal explants and support cell migration. For this purpose, human-derived amniotic membrane (AM) (frozen-thawed-de-epithelialized) which is frequently used in the literature and human-derived platelet-rich fibrin (PRF) (1000 rpm 5 min), which was chosen as the original point of this study, were used. When the prepared surfaces were examined with phase contrast microscopy (PCM) and scanning electron microscopy, it was observed that the surface of the AM consisted of more tightly positioned fibers than the surface of the PRF. Then, the modified culture media prepared with a 14-day incubation of PRF prepared with standard protocol (2700 rpm 12 min) and human-derived AM (fresh) were used during in vitro cell culture studies. The release kinetics of all biomaterials used to prepare the culture medium and culture surface are evaluated by in vitro release studies: The biomaterial with the highest concentration for epidermal growth factor (EGF) and transforming growth factor-β (TGF-β) was PRF prepared with a 2700 rpm 12 min protocol; and the biomaterial with the highest concentration for vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A) was fresh AM. After the characterization studies were completed, 4 different groups were formed and cell culture studies were carried out. Group 1 consisted of AM surface coating and standard media, Group 2 consisted of AM surface coating and AM modified media, Group 3 consisted of PRF surface coating and standard media, Group 4 consisted of PRF surface coating and PRF modified media. Thirty-two donor cornea-scleral rim without statistical difference in terms of demographics were randomly distributed into groups, and a 14-day cell culture study was performed. Morphology of the migrating cells during culture was followed by PCM and live cell imaging systems. At the end of the fourteenth day, cell morphology with cell skeletal/nuclear staining, viability of cells with live/dead staining, stemness of cells with immunocytochemical staining were evaluated and the groups were compared. In addition, quantitative comparisons between groups were made by calculating the percentages of expression of the markers by flow cytometer analysis. Finally, real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis was performed to determine gene expression levels. Semi-quantatively evaluated staining results and quantitatively evaluated flow cytometer and RT-PCR results showed that the cells fed with media modified with PRF on the surfaces coated with PRF favored LESC more in terms of morphological and stem cell markers. The obtained data in this thesis study show that, the originally constructed human fibrin coating stimulates LESC migration in the limbal explant culture, preserving the stemness. These results emphasize the importance of a new cell culture system which is based entirely on human-derived products and which has advantages over standard methods used in the LESC culture, alternatives of which is being searched for because of their disadvantages.