Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis enfeksiyonu teşhis edilen koyunların gama-interferon, interlöykin-10 ve neopterin düzeyleri

Abstract

Paratüberküloz, Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (Map) tarafından oluşturulan, kronik, granülomatöz enterit ile karakterize bir hastalıktır. Hastalığın evrelerine göre tanıda farklı testler kullanılmaktadır. Bu çalışma ile koyunlarda interferon gama (IFN-γ) ELISA, antikor ELISA, Ziehl-Neelsen (ZN) boyama, polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ve kültür yöntemleri ile hastalığın araştırılması ve pozitif ve negatif olarak belirlenen koyunlarda antikor, IFN-γ, interlöykin-10 (IL-10) ve neopterin (NP) düzeylerinin karşılaştırılması amaçlandı. Bu amaçla, Burdur ilinde 15 koyun sürüsünde 2 yaş ve üzerindeki onar hayvandan olmak üzere toplam 150 kan ve gaita örneği alındı. Kan serumu örnekleri Map'e karşı gelişen antikorlar, plazma örnekleri ise IFN-γ yönünden ELISA ile incelendi. Gaita örnekleri ise ZN boyama, PZR ve kültür için kullanıldı. Dekontaminasyon sonrası gaita örneklerinin HEYM ve modifiye Middlebrook 7H10 agar besiyerlerine ekimleri yapıldı. Aynı gaitalardan izole edilen DNA örnekleri Map'e spesifik iki primer çifti (P90/P91 ve 150C/921) kullanılarak klasik ve nested PZR ile incelendi. Gaita ve Map izolatlarından elde edilen DNA örnekleri IS1311 gen bölgesine yönelik uygulanan PZR işleminden sonra restriksiyon endonükleaz analizi (REA) ile tiplendirildi. Pozitif ve negatif olarak belirlenen kırkar koyunun antikor, IFN-γ, IL-10 ve NP düzeyleri ortalama optik dansite (OD) değerlerine göre karşılaştırıldı. Çalışmadaki 150 koyundan 73'ünün enfekte olduğu belirlendi. PZR-REA ile enfeksiyona neden olan Map'in koyun tipi olduğu tespit edildi. Testlerin hepsinde pozitif sonuç veren bir koyun tespit edilemedi ve en yüksek pozitiflik oranları ZN boyama (%27,33) ve PZR (%26,66) ile saptandı. Bunu sırasıyla IFN-γ ELISA (%22), antikor ELISA (%10,67) ve kültür (%3,33) yöntemleri izledi. Kültür sonuçları ile karşılaştırıldığında; ZN boyama, PZR, IFN-γ ve antikor ELISA testlerinin sensitivite ve spesifiteleri sırasıyla %80-%74, %60-74, %20-%77, %20-%89 olarak hesaplandı. Paratüberküloz yönünden pozitif ve negatif olarak değerlendirilen hayvanların yaş grupları arasında istatistiksel olarak bir fark (p>0,05) saptanmazken, diyare bulgusu ve vücut kondüsyon skorları arasındaki fark (p<0,01) anlamlı bulundu. Pozitif hayvanların antikor, IFN-γ, IL-10 ve NP düzeyleri negatif hayvanlardan daha yüksek bulunmasına rağmen, istatistiksel olarak önemli fark antikor, IFN-γ ve IL-10 düzeylerinde belirlendi (p<0,01). Pozitif hayvanlar arasında IL-10 düzeylerinin (p>0,05) aksine, antikor, IFN-γ ve NP düzeyleri farklı bulundu (p<0,01). Sonuç olarak; koyunlarda paratüberkülozun hastalığın evresine bağlı olarak 2 yaş kadar erken bir dönemde IFN-γ ELISA, antikor ELISA, ZN boyama, PZR veya kültür yöntemleri ile tespit edilebileceği, ancak hastalığın klinik aşamasında ZN boyama veya sensitivitesi ve spesifitesi daha yüksek bulunan PZR gibi yöntemlerin kullanılabileceği kanısına varıldı. Diğer taraftan pozitif ve negatif hayvanlarda IL-10 düzeylerinin çok farklı bulunması ve enfeksiyonun her döneminde serumda ölçülebilir olması nedeniyle IFN-γ gibi tanı amacıyla bu sitokinden de yararlanılabileceği düşünüldü.

Paratuberculosis is a disease caused by Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (Map) and characterized by chronic granulomatous enteritis. Different tests are used in the diagnosis according to the stage of the disease. The purpose of the present research was to investigate paratuberculosis infection in sheep by interferon gamma (IFN-γ) ELISA, antibody ELISA, Ziehl-Neelsen (ZN) staining, polymerase chain reaction (PCR) and culture methods and to compare the antibody, IFN-γ, interleukin -10 (IL-10) and neopterin (NP) levels between animals determined as positive and negative for paratuberculosis. Two years and older sheep were included in the study. Ten sheep from each of 15 sheep farms were selected randomly in Burdur province and total 150 blood and fecal samples were collected. Blood serum samples were examined for antibodies against Map and plasma samples were analyzed by ELISA for IFN-γ. Stool samples were used for ZN staining, PCR and culture. After decontamination, stool samples were planted on HEYM and modified Middlebrook 7H10 agar media. The DNA samples extracted from the fecal samples were analyzed by classical and nested PCR using two Map specific primer pairs (P90/P91 and 150C/921). DNA samples obtained from stool samples and Map isolates were typed by restriction endonuclease analysis (REA) after PCR procedure for IS1311 gene region. The levels of antibody, IFN-γ, IL-10 and NP in 40 sheep determined as positive and 40 sheep determined as negative were compared based on the mean optical density (OD) values. Of the 150 sheep in the study, 73 were found to be infected. The type of Map was determined to be sheep type by PCR-REA. None of 73 sheep were positive for all of the tests and the highest rate of positivity was determined by ZN staining (27,33%) and PCR (26,66%). This was followed by IFN-γ ELISA (22%), antibody ELISA (10.67%) and culture (3.33%). According to the culture results; the sensitivity and specificity of the ZN staining, PCR, IFN-γ and antibody ELISA tests were calculated as 80-74%, 60-74%, 20-77%, 20-89% respectively. There was no statistically significant difference (p>0,05) between the age groups of animals determined as positive and negative for paratuberculosis, whereas the difference between diarrhea and body condition scores was significant (p<0,01). Although antibody, IFN-γ, IL-10 and NP levels of positive animals were higher than negative animals, statistically significant difference was determined in antibody, IFN-γ, and IL-10 levels (p<0,01). In positive animals, except IL-10 levels (p>0,05), the difference was determined in antibody, IFN-γ and NP levels (p<0,01) between animals groups constituted according to test results. As a result; It was concluded that paratuberculosis can be detected by IFN-γ ELISA, antibody ELISA, ZN, PCR or culture methods in sheep as early as 2 years old depending on the stage of the disease, but ZN staining or PCR methods with higher sensitivity and specificity can be used in the clinical stage of the disease. On the other hand, since IL-10 levels were found to be very different between positive and negative animals and measurable in serum at every period of the infection, it was thought that this cytokine could be used for diagnosis as IFN-γ.