Farklı vitrifikasyon yöntemleri ile dondurulan sığır oositlerinin çözdürme sonrası in vitro maturasyon başarıları

Abstract

Bu çalışmanın amacı; immatür sığır oositlerinin OPS ve SSV vitrifikasyon yöntemleriyle dondurulması ve bu yöntemlerin maturasyon üzerine etkilerinin araştırılmasıdır. Mezbahada kesilen hayvanların ovaryumlarından toplanan oositler stereomikroskop altında incelendi ve etrafı en az 3 kat sıkı kumulus hücreleriyle çevrili 450 oosit kullanıldı. Vitrifikasyon yöntemine göre OPS, SSV ve kontrol grubu olarak 3 grup oluşturuldu. OPS grubundaki oositler; %20 CS, %10 EG ve %10 DMSO içeren TCM199 medyumunda 30-45 sn bekletildi ve %20 CS, %20 EG, %20 DMSO ve 0.5M sükroz içeren TCM199 medyumunda 20 sn bekletilerek OPS yöntemiyle vitrifiye edildi. SSV grubundaki oositler; %20 CS ve %4 EG içeren TCM199 medyumunda 12-15 dk bekletildi ve %20 CS, %35 EG, %5 PVP ve 0.4 M trehaloz içeren TCM199 medyumunda 25-30 sn bekletilerek SSV yöntemiyle vitrifiye edildi. Vitrifiye edilen oositler, sıvı azot içerisinde en az 1 ay saklandıktan sonra çözdürülerek IVM'a alındı. Kontrol grubundaki oositler, vitrifiye edilmeksizin IVM'a alındı. IVM işlemi, %10 FCS, 5 µg/ml LH, 0.5 µg/ml FSH, 27.5 µg/ml Na-piruvat ve antibiyotik içeren TCM199 medyumu kullanılarak, 38.5°C'deki %5 CO2'li etüvde 24 saatte yapıldı. Maturasyon sonrasında kumulus ekspansiyonu incelendiğinde, OPS grubunda 146 oositten 118'inde (%80.82) 2 derecede, 22'sinde (%15.07) 1 derecede ve 6'sında (%4.11) 0 derecede kumulus ekspansiyonu gözlendi. SSV grubunda 144 oositten 113'ünde (%78.47) 2 derecede, 20'sinde (%13.89) 1 derecede ve 11'inde (%7.64) ise 0 derecede kumulus ekspansiyonu gözlendi. Kontrol grubunda 150 oositten 144'ünde (%96.00) 2 derecede, 4'ünde (%2.67) 1 derecede ve 2'sinde (%1.33) ise 0 derecede kumulus ekspansiyonu gözlendi. Soyulan oositlerde polar body incelendiğinde, OPS grubunda 138 oositten 32'sinde (%23.19) polar body bulunduğu, 96'sında (%69.56) polar body bulunmadığı ve 10 oositin (%7.25) ise dejenere olduğu belirlendi. SSV grubunda 134 oositten 28'inde (%20.90) polar body bulunduğu, 95'inde (%70.90) polar body bulunmadığı ve 11 oositin (%8.20) ise dejenere olduğu belirlendi. Kontrol grubunda 137 oositten 108'inde (%78.83) polar body bulunduğu, 25'inde (%18.25) polar body bulunmadığı ve 4 oositin (%2.92) ise dejenere olduğu belirlendi. OPS ve SSV grupları arasında önemli derecede bir fark bulunmadı (p˃0.05). Vitrifikasyon grupları, kontrol grubuna kıyasla önemli derecede düşük bulundu (p˂0.001). Çalışmanın sonucunda, immatür sığır oositlerinin OPS ve SSV vitrifikasyon yöntemleriyle vitrifiye edilebileceği gösterilmiştir.Anahtar Kelimeler: Çözdürme, İn vitro maturasyon, Sığır oositleri, Vitrifikasyonyöntemleri

The purpose of this study; is freezing of immature bovine oocytes with vitrification methods of OPS and SSV and investigating the effects of these methods on maturation. The oocytes collected from the ovaries of the animals slaughtered in the local abattoir were examined under a stereomicroscope and 450 oocytes were used surrounded by at least 3 layers cumulus cells. According to the vitrification method, OPS, SSV and control groups were formed. Oocytes in the OPS group; were exposed TCM199 medium containing 20% CS, 10% EG and 10% DMSO for 30-45 seconds and vitrified by OPS method exposed TCM199 medium containing 20% CS, 20% EG, 20% DMSO and 0.5M sucrose for 20 seconds. Oocytes in the SSV group; were exposed TCM199 medium containing 20% CS and 4% EG for 12-15 minutes and vitrified by SSV method exposed TCM199 medium containing 20% CS, 35% EG, 5% PVP and 0.4 M trehalose for 25-30 seconds. The vitrified oocytes were thawed after storage in liquid nitrogen for at least 1 month and incubated for IVM. Oocytes in the control group were subjected to IVM without vitrified. The IVM procedure was performed in a 5% CO2 incubator at 38.5 ° C for 24 hours using IVM medium (TCM199 medium containing 10% FCS, 5 µg/ml LH, 0.5 µg/ml FSH, 27.5 µg/ml Na-pyruvate and antibiotics). When examined to cumulus expansion after maturation, in the OPS group, 118 (80.82%) of 146 oocytes are degree 2, 22 (15.07%) oocytes are degree 1 and 6 (4.11%) oocytes are degree 0 cumulus expansion. In the SSV group, 113 (78.47%) of 144 oocytes are degree 2, 20 (13.89%) oocytes are degree 1 and 11 (7.64%) oocytes are degree 0 cumulus expansion. In the control group, 144 (96.00%) of 150 oocytes are degree 2, 4 (2.67%) oocytes are degree 1 and 2 (1.33%) oocytes are degree 0 cumulus expansion. When examined the polar body in the denuded oocytes, in the OPS group, 32 (23.19%) of 138 oocytes had polar body, 96 (69.56%) oocytes had no polar body and 10 (7.25 %) oocytes were degenerated. In the SSV group, 28 (20.90%) of 134 oocytes had polar body, 95 (70.90%) oocytes had no polar body and 11 oocytes (8.20%) were degenerated. In the control group, 108 (78.83%) of 137 oocytes had polar body, 25 (18.25%) oocytes had no polar body and 4 (2.92%) oocytes were degenerated. There was no significant difference between OPS and SSV groups (p˃0.05). Vitrification groups were significantly lower than the control group (p˂0.001). The result of the study shows that immature bovine oocytes can be vitrified with OPS and SSV methods.Keywords: Thawing, In vitro maturation, Bovine oocytes, Vitrification methods.