Investigation of cloning strategies for A.thaliana G protein α-subunit gene in Pichia pastoris

Abstract

Bu tezde A. thaliana heterotrimerik G-proteini a alt birimi geninin klonlanması ve ifadesi için yapılan çalışmalar sunulmuştur. Bu amaç doğrultusunda bol miktarda ve yüksek saflıkta rekombinant protein üretimi için uygun bir ökaryotik ifade hücresi seçilmiştir. Polimeraz zincir reaksiyonu sonucu elde edilen GPAl'nın Pichia Pastoris ifade vektörlerine takılmasıyla iki değişik plazmit pPICZC+GPAl ve pPICZaB+GPAl ' oluşturulmuştur. pPICZC+GPAl hücre içi ifade için tasarlanmıştır, öte yandan pPICZaB+GPAl' ise ifade edilen proteine eklenen sinyal dizisi aracılığıyla proteinin hücrenin dışına salgılanmasını sağlamaktadır. Değişik türdeki maya hücrelerinin kullanılmasıyla ifadeyi optimize etme imkanları üzerinde çalışılmıştır. Rekombinant GPAİ pPICZC+GPAl plazmiti ve GS115 hücrelerinin kullanılması sonucu sentezlenmiş ve protein ifadesi maya büyüme eğrileri ve western blot analizleri ile gözlenmiştir. Bu çalışma A. thaliana GPAİ geninin bir ökaryotik hücrede ifadesini gösteren ilk çalışmadır. Saflaştınlmış rekombinant GPAİ biyokimyasal incelemeleri, memeli sistemlerden eş değer proteinler ile karşılaştırmaları ve yapı analizlerini mümkün kılacaktır.

In this thesis a strategy was developed to clone and express the gene of the A. thaliana heterotrimeric G-protein a subunit (GPA1). For this purpose an appropriate eukaryotic expression system was chosen to produce large quantities of high purity recombinant protein. GPA1 was amplified by PCR and cloned using a Pichia pastoris expression system. Two different plasmids pPICZC+GP^i and pPICZaB+GP^i ' were constructed. pPICZC+G/Mi was designed for intracellular expression whereas pPICZaB+GP/47 ' contained a signal peptide facilitating secretion of the recombinant protein into the extracellular medium. The possibility of using different yeast strains that may improve expression was explored. Recombinant synthesis of GPA1 was achieved with the pPICZC+GiMi construct using the strain GS1 15, which shows Mut+ phenotype. Expression was followed by monitoring growth of yeast as well as western blots of cellular extracts at different time points during induction. This study describes the first report of expression of A. thaliana GPA1 gene in a eukaryotic system and constitutes a critical step forward in studies of G-proteins in plants. It follows to reason that the availability of purified recombinant GPA1 will enable biochemical characterization, comparison with its mammalian counterparts and facilitate structural studies.