Cloning, characterization and expression of a novel metallothionein gene from triticum durum and theoretical and experimental structure-function relationship prediction

Abstract

ÖZETMetallotioninler (MT'ler) hemen hemen tüm organizmalarda bulunan sistinbakımından zengin, düşük molekül ağırlıklı polipeptitlerdir. Hücre içerisinde bulunanağır metallerin detoksifikasyonu ve bakır, çinko gibi yaşam için gerekli eserelementlerin metabolize edilmesi görevlerini yürüttükleri düşünülmektedir.Memelilerdeki eşleniklerinin tersine, bitki metallotioninleri hücre içerisindekifonksiyonları ve regülasyonları açısından tam olarak karakterize edilmemişlerdir.Triticum durum'dan (makarnalık buğday) tip 1 bitki metallotionini kodlayan yenibir gen tanımlanmıştır. Gen karaterizasyonu çalışmalarının sonuçlarına göre Triticumdurum mt geni 2 ekzon ve 1 kodlamayan intron kısımlarını içerir. mt geninin kodladığırekombinant protein literatürde bitki metallotionein proteinleri ile ilk deneysel yapıverilerini elde etmek amacıyla E. coli'de sentezlettirilmiş ve rekombinant MT ilesolüsyon X-ışını saçılımı deneyleri başlatılmıştır.Kodlanan MT proteininin amino asit dizisindeki sistin gruplarının dağılım düzeniaçısından memeli MT'lerine çok büyük bir benzerlik gösterdiği ancak durum MT'sinin(dMT) metal bağlayan iki bölümünün alışılmadık uzunlukta bir köprü bölgesiylebirbirlerine bağlandıkları gösterilmiştir. Mevcut protein verileri üzerine uygulanan dizieşleştirme algoritmaları yardımıyla bu köprü bölgesinin bitki MT'leri arasındakorunduğu ispatlanmıştır.dMT'nin üç-boyutlu yapısını tahmin etmek için homolog modelleme ve iz sürücü(heuristic) parça bütünleştirici yaklaşımları kullanılmıştır. Tahmin edilen yapılarkullanılarak, işlevsel motif ve yapı aramaları yapılmış ve bu aramalar sonucunda dMTiçin DNA veya proteine bağlanma fonksiyonları öngörülmüştür. Yapılan tahminlerviçerçevesinde dMT'nin çözelti içerisinde dimer ve trimer oluşturma ihtimalleri detartışılmış ve öngörülmüştür.dMT ekpresyonu E. coli içerisinde GST'ye bütünleşik füzyon proteini olarakgerçekleştirilmiştir. Yukarıda sözü edilen teorik sonuçlar rekombinant dMT veGSTdMT ile solüsyon X-ışını saçılımı ölçümleri, poliakrilamid jel elektroforezi ve jelfiltrasyon kromatografisi yöntemleri kullanılarak elde edilen deneysel bulgularladesteklenmiştir.Detaylı ve geniş kapsamlı dizi ve yapı analizleri, bitki MT'sinin köprü bölgesiylesayanobakteriel MT baskılayıcı protein (SmtB) DNA bağlanma bölgesi arasındaoldukça yüksek oranda bir benzerlik ortaya çıkarmışlardır. Aynı zamanda dMT'ninmetal bağlayan bölümlerinin de yüksek oranda DNA'ya bağlanma olasılıklarıgösterilmiştir. Tüm sonuçlar birlikte değerlendirildiklerinde, bitki MT proteinleri içinmetal bağlama yanısıra transkripsiyon faktörü ya da gen baskılayıcı olmak gibi yeni birişlevi de işaret etmektedirler.vii

ABSTRACTMetallothioneins (MTs) are small, cystein rich, low molecular mass polypeptidesfound in almost all organisms. They are thought to be involved in heavy-metaldetoxification and metabolism of essential trace elements like copper and zinc. Unliketheir mammalian counterparts, plant MTs have not been thoroughly characterized interms of cellular regulation and function.A novel gene, from Triticum durum (pasta wheat), coding for plant MT type 1protein was isolated and characterized. The durum mt gene was cloned in E. coli forsolution X-ray scattering studies to obtain the first experimental structural data on aplant MT in the literature. Triticum durum mt gene was shown to contain 2 exons and anon-coding intron region.The coded MT protein, showing high similarity to mammalian MTs in its cysteinresidue distribution pattern, forms two metal binding domains bridged with anexceptionally long connecting region. This hinge region was shown to be highlyconserved among plant MTs using sequence alignment algorithms on data available inthe literature.Homology modeling and heuristic fragment assembly approaches were used topredict a 3D structure for the durum MT (dMT). Guided by the predicted structures,functional motif and structure searches were performed yielding a possible DNAbinding and/or protein interaction function for dMT. High probability of wMT to formdimers or trimers inside the solution was also speculated.dMT was expressed in E. coli cells as a fusion protein with GST and preliminaryX-ray solution scattering measurements were carried out on the purified recombinantivprotein. These measurements indicated the high tendency of the protein to formaggregates in solution. Theoretical predictions and solution scattering measurementswere also supported by the results of polyacrylamide gel electrophoresis and sizeexclusion chromatography analysis of expressed and purified recombinant dMT andGSTdMT proteins.Further, sequence and structure analyses showed a high structure and sequencesimilarity between dMT hinge region and the DNA binding domain of a cyanobacterialmetallothionein suppressor protein (SmtB). Indeed, the results indicate that dMT metalbinding domains would also bind to DNA with very high probability. These results,altogether, point to a new role for plant MTs other than metal scavenging such as beinga transcription factor or a gene suppressor.v