Klinik örneklerden izole edilen pseudomonas aeruginosa kökenlerinin proteaz aktivitelerinin (elastaz ve alkali proteaz) değişik yöntemlerle gösterilmesi

Abstract

ÖZET Pseudomonas aeruginosa primer olarak hastane infeksiyonu etkeni olan fırsatçı bir patojendir. Konak savunması bozulduğu zaman oldukça virulan olup özellikle bağışık ödünlü (kanser, yanık, travma, kistik fibroz) kişilerde ciddi infeksiyonlara neden olan bir mikroorganizmadır. Pseudomonas aeruginosa infeksiyonlannm patogenezinde çeşitli virülans faktörleri rol oynar. Bunlar içinde elastaz, alkali proteaz, aljinat, ekzotoksin A ve fosfolipaz C sıklıkla suçlanan hücre dışı ürünlerdir. Çalışmamızda çeşitli klinik örneklerde etken olarak izole edilen 50 Pseudomonas aeruginosa kökeni çalışmaya alınmıştır. Bakterinin virülansında önemli olarak kabul edilen, elastaz ve alkali proteaz enzimlerinin aktivitesinin saptanmasında değişik yöntemler karşılaştınlmıştır. Elastaz aktivitesinin belirlenmesinde elastin-nutrient ağarda çizgi ekimle zon, bu ağarda açılan kuyucuklarda süpernatanın oluşturduğu zon ve elastin kongo kırmızısıyla süpernatanın oluşturduğu absorbans değerleri karşılaştuılmıştır. Elastin kongo kırmızısı yöntemi ile süpernatanlar arasındaki ilişki katsayısı (r=88.4, p < 0.001), elastin kongo kırmızısı yöntemi ile çizgi (r= 84.6, p < 0.001) ve çizgi ile süpernatanlar (r=76.8, p < 0.001) arasındakine göre daha yüksek bulunmuştur. Ağarda süpernatan zonunun ölçülmesi rutin laborotuvarda kullanılabilecek bir yöntem olarak önerilebilir. Alkali proteaz enziminin saptanmasında süpernatanın BKI- yağsız sütlü 42 iağarda oluşturduğu zon, azur mavisiyle verdiği aborbans ve 2İmogram yöntemiyle oluşturduğu banûar karşılaştinlmıştır. Alkali proteaz aMvitesinin belirlenmesinde BKI- yağsız sütlü agar ve azur mavisi yöntemi karşılaştırıldığında ileri derecede anlamlı bir ilişki (r=87.40, p değeri 0.001'den küçük) saptanmıştır. Zimogram SDS-PAGE yönteminde ise standart enzim sağlanamadığında kantitasyon yapılamamasına rağmen, şeffaf bantların büyüklükleri diğer iki yöntemle parelellik göstermiştir. Alkali proteaz enziminin saptanmasında BKI- yağsız sütlü agar yöntemi diğer İM yönteme göre basit ve her laboratuvar şartlarında kolayca uygulanabilir bir yöntem olduğunda dolayı tercih edilebilir. 43

< SUMMARY Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen mainly isolated from nosocomial infections when host defense mechanisms are destroyed especially in cancer, burn, trauma patients. Several virulence factors are important in disease pathogenesis, among them elastase, alkaline protease, alginate, exotoxin A are commonly encountered ones. Fifty Pseudomonas aeruginosa strains isolated from different clinical samples are included in this study. Different methods are compared for detection of protease activity (elastase, alkaline protease) of the strains. Elastase activity was determined by three different methods including direct inoculation of the strains into elastin -nutrient agar, detection of the zone diameter of the supernatant on the agar and detection of the absorbance value by elastin-congo red method. Correlation rate between elastin congo red and supernatant was found higher (r=87.15, p < 0.001), than the rate between elastin congo red and direct inoculation (r= 85.40, p < 0.001) and supernatant and direct inoculation (r=85.45, p < 0.001). Measurement of the zone diameter of the supernatant in the elastin -nutrient agar can be suggested as an easy method for routine laboratories. Alkaline protease activity was determined comparing the zone diameter produced by the supernatant in the BHI-skim milk agar, the absorbance value by azure blue method and the bands produced by the zymography SDS-PAGE assay. When we compared BKI-skim milk agar to azure blue method for determination 44of alkaline protease activity, we have found a significant relationship (r greater than 0.87, p less than 0.001). Although quantitation could not be possible because of the inavailability of the standart enzyme by zymography SDS-PAGE assay, the size of lysed bands were in parellel by other two assays. BKI-skim milk agar assay could be preferred through other two assays for alkaline protease enzyme activity determination, since it is rather simple and could be applied in every laboratory conditions. 45