Trichopyhton sp. suşundan keratinaz izolasyonu ve kısmi karakterizasyonu

Abstract

Bu çalışmada, Kahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi Dermatoloji Polikliniğine başvuran hastaların deri ve saç yüzeylerinden Trichophyton sp. izolasyonu yapıldı. Trichophyton sp. suşları sabouraud dekstroz broth besiyerinde geliştirildi. Enzim üretimi mineral besiyerinde ve keratin tozunun karbon kaynağı olarak kullanılmasıyla gerçekleştirildi. Suşlar kazeinolitik aktiviteleri açısından kıyaslandı (skim-milk agarda). Suşlar içerisinde Tr-9 maksimum kazeinolitik aktivite gösterdi ve en iyi keratinaz üreticisi seçildi. Süpernatanttan enzimin saflaştırılması için Amonyum sülfat presipitasyonu, Sephadeks G-100 ve DEAE Sepharose kolon kromatografisi uygulandı. Keratinaz enziminin moleküler ağırlığı SDS page ve zimogram uygulanarak yaklaşık 34 kDa olarak tahmin edildi. Keratinaz aktivitesi keratin azurun substrat olarak kullanılmasıyla belirlendi Tr-9 keratinazın optimum pH ve sıcaklık değerleri sırasıyla 7.5 ve 37°C olarak belirlendi. Tr-9 Keratinaz enziminin pH 5.5-8.0 aralığında ve 20°C den 40°C `ye kadar stabil olduğu görüldü. Tr-9 Keratinaz tüy parçalama için de test edildi ve 15 gün içinde tavuk tüyünü başarılı bir şekilde parçaladığı sonucunu gösterdi.Şelatör, inhibitörler ve metal iyonlarını içeren bazı kimyasalların keratinolitik aktivite üzerindeki etkileri enzimin 30 dk bu maddelerle (1-5 mM, %1) ön inkübasyonu yapılarak çalışıldı. CaCI2 (5mM) keratinaz aktivitesini (%148) stimüle edici etki gösterdi. Diğer taraftan EDTA (5mM) ve SDS (%1) sırasıyla %49, % 49 etki göstererek kısmen inhibe etti, PMSF (1mM ve 5mM) ile tam inaktivasyon elde edildi. Bu durum enzimin serin proteaz olduğunu göstermektedir.Sonuçlar keratinaz enziminin nonpatojen endüstriyel mikroorganizmalara aktarılabilirse keratinolizis gerektiren endüstriyel ve biyoteknolojik uygulamalar ve tüy unu (feather meal) üretimi gibi işlemler için daha kullanışlı olacağını göstermektedir.

In this study, Trichophyton sp. was isolated from patients? skin and hair surface who applied to Kahramanmaraş Sutcu Imam University Dermatology polyclinic. Trichophyton sp. was grown in sabouraud dextrose broth medium. Enzyme production was accomplished in mineral medium and keratin powder served as a carbon source. Caseinolytic activities were compared between the strains (on skim milk agar). Among the strains Tr-9 showed the maximum caseinolytic activity and was selected the best keratinase producer. The supernatant was subject to Ammonium sulphate precipitacion, Sephadex G-100 column and DEAE Sepharose column chromatography for purification of enzyme. The molecular weight of keratinase was estimated to be 34 kDa by SDS page and zymogram analyses were carried out. Keratinase activity was determinated using keratine azure as a substrate.The optimum pH and temperature Tr-9 keratinase were determined to be 7.5 and 37°C, respectively. The activity of keratinase was stable in the pH range 5.5-8.0 for 30 min and temperatures from 20-40°C. Tr-9 Keratinase was also tested for feather degradation and presented a result degrading chicken feathers succesfully in 15 days. The effect of some chemicals including chelating agents, inhibitors and metal ions on keratinolytic activity was studied pre incubating the enzyme in presence of substances (1mM, 5mM, 1%) for 30 min. CaCI2 (5mM) showed a stimulatory effect on keratinase activity (148 %) on the other hand, EDTA (5mM) and SDS (1%) inhibited enzyme partially as 49 %, 49 % respectively. Complete inactivation of enzyme was obtained with PMSF (1mM and 5mM) which indicates that enzyme is a serin protease.The results show that if Tr-9 keratinase gene is transferred to another non-pathogenic industrial microorganism it will be more functional, such as industrial and biotechnological applications requiring keratinolisis, pruducing feather meal.