Schizosaccharomyces pombe`de mitotik mikrotübül oluşumu üzerine magnezyumun etkisi

Abstract

Schizosaccharomyces pombe' de MİTOTİK MİKROTÜBÜL OLUŞUMU ÜZERİNE MAGNEZYUMUN ETKİSİMagnezyum (Mg2+), hücresel sistemlerde en çok bulunan divalent katyon olup, birçok biyolojik fonksiyon için önemlidir. Biyomembranların ve nükleik asitlerin kararlılığını sağlar; DNA, protein sentezi ve iyon kanallarının çalışmasının düzenlenmesi gibi birçok hücresel işlevden sorumlu 300' den fazla enzimin ko-substratıdır. Ayrıca magnezyum, mikrotübül polimerizasyonu ve sitokinez gibi diğer hücresel işlevlerle de ilgilidir. Kardiyovasküler hastalıklar, primer hipertansiyon, diabet ve metabolik sendrom gibi pekçok hastalık, Mg2+ homeostasisinin bozulmasıyla ilişkilidir.Mitozun ilk aşamalarında, mitotik mikrotübüllerin polimerizasyonu, Mg2+ ve GTP varlığında gerçekleşir. Önceleri yapılan bir çalışmada, hücreler büyürken hücre içi Mg2+ konsantrasyonunun düştüğü ve bunun mitotik mikrotübüllerin oluşumunu sağladığı, hücre bölünmeden önce hücre içinde Mg2+ konsantrasyonunun artarak mitotik mikrotübüllerin depolimerize olduğu yönünde bir hipotez öne sürülmüştü. Magnezyumun, mikrotübüllerin polimerizasyonunu teşvik ettiği bilinmesine rağmen, hücre bölünmesi öncesinde mitotik mikrotübüllerin depolimerizasyonunu nasıl sağladığını gösteren özgün bir çalışma bulunmamaktadır. Ayrıca bu zamana kadar, Mg2+' nın mikrotübüller üzerindeki ekisini anlamak amacıyla, mikrotübüllerin floresan mikroskobunda görünür hale gelmesi için immunofloresan yöntem kullanılmıştır. Bu yöntem hücrelerin fikse edilmesini gerektiren bir yöntem olup, Mg2+'nin mitotik mikrotübüller üzerine etkisi gösterilmemiştir. Dolayısla Mg2+'nın mitotik mikrotübüller üzerine etkisini göstermek için, Schizosaccharomyces pombe'nin, bilinen iki magnezyum transport geni bakımından delesyonlu ikili mutant ırkı ve bu ırkın elde edildiği magnezyum transport sistemine sahip atasal ırkı, kontrol olarak kullanıldı. Mikrotübülleri floresan mikroskobunda görünür hale getirmek için, iki ırka, GFP işaretli alfa 2 tubulin geni taşıyan pDQ105 plazmiti aktarıldı. Magnezyumun GFP işaretli mitotik mikrotübüller üzerine etkisini göstermek ve eş zamanlı olarak da serbest Mg2+'nın kantifikasyonunu yapmak için, iyon formundaki Mg2+'ya özgün Mag-fura 2 AM probu kullanıldı.Sadece iyon formundaki Mg2+'nin kantifikasyonu için oldukça duyarlı olan orantısal görüntüleme (ratiometric imaging) yöntemi kullanılarak, hücre içi serbest Mg2+'nın, ikili mutantta kontrole göre daha düşük olduğu gösterildi. Schz. pombe'de mag-fura 2 AM probunun kalibrasyon güçlüğü nedeniyle, hücre içi Mg2+ kantifikasyonu yapılamadı. GFP işaretli mikrotübüllerin mag-fura 2 probuna karşı oldukça duyarlı olduğu gösterildi ve mag-fura 2 yüklü hücrelerde mikrotübüller gözlenemedi. Bu nedenle mikrotübüllerin ve serbest magnezyumun eş zamanlı gösterebilmesi için, kullandığımız yöntemin geliştirilmesi gerektiğine karar verildi. Diğer taraftan ikili mutantta başlangıçta sağlıklı interfaz mikrotübülleri görülmesine rağmen, ilk hücre bölünmesinden sonra, kısa, daha az sayıda ve organizasyonu bozulmuş interfaz mikrotübülleri görüldü. Kontrol ırkta dördüncü bölünmeden sonra mikrotübüller görülmez hale gelirken, ikili mutantta ikinci bölünmeden sonra mikrotübüller görülmez hale geldi. Bu durumun, ikili mutantın mikrotübül polimerizasyonu için gerekli Mg2+' yı, ya pasif yolla sınırlı olarak dış ortamdan almasından ya da mitokondri gibi hücre içi Mg2+ depolarından kullanmasından ileri geldiği düşünüldü. Ayrıca logaritmik fazda, kontrol ırka ait hücrelerde mitotik mikrotübül yüzdesi %17 iken, ikili mutant hücrelerinde %4 olup hücrelerin ~ %70'inin uzun, septumsuz ve tek nukleuslu olduğu gözlendi. Bu bulgulara dayanarak, ikili mutant ırka ait hücrelerinin, hücre döngüsünün G2-M evresinde tutuklandığı düşünüldü. Bulgularımız Mg2+ eksikliğinin, mitotik mikrotübüllerin oluşumunu engellediğini, dolayısıyla mitotik mikrotübül oluşum kontrol noktasının etkilenerek, hücre döngüsünde tutuklanmaya yol açmış olabileceğini göstermektedir. Magnezyum eksikliğinin, mitotik mikrotübüller ve de mikrotübül oluşum kontrol noktasına olan etkisinin daha iyi anlaşılabilmesi için, ikili mutantın model hücre olarak kullanılarak, gen anlatım profillemesi yapılmasına gereksinim vardır.

The Effect of Magnesium on the Formation of Mitotic Microtubules in Schizosaccharomyces pombeMagnesium (Mg2+) is the most abundant intracellular divalent cation in cellular systems and important in a great variety of biological functions. It stabilizes biomembranes and nucleic acids and cosubstrate for more than 300 enzymes related multiple cellular processes like DNA, protein synthesis and modulation of ion channels. Magnesium is involved in many other cellular processes such as microtubule polymerization and cytokinesis. An abnormal Mg2+ homeostasis is associated with several disease conditions, such as cardiovascular diseases, essential hypertension, diabetes mellitus, and metabolic syndrome.In the first stages of mitosis, polymerization of microtubules occurs in the presence of magnesium and GTP. According to a hypothesis from a previous study; when cells grow, intracellular Mg2+ concentration falls. This triggers the formation of mitotic microtubules. Shortly before cell division, rapid Mg2+ influx occurs and intracellular Mg2+ reaches to a concentration that brings about mitotic microtubules breakdown. However the stimulating effect of magnesium on polymerization of microtubules was known, there hasn?t been any spesific research that shows how magnesium causes depolymerisation of mitotic microtubules before cell division. Also until now, to make microtubules visible, immunofluorescence technique that is only limited to fixed (i.e., dead) cells, has been used to understand the effect of Mg2+ on interphase microtubules not mitotic microtubules. So to show the effect of magnesium on mitotic microtubules during mitosis, two Schizosaccharomyces pombe strains were used. One is double mutant strain which was deleted in terms of two essential magnesium transporter genes and its parental strain which has magnesium transport system as a control. The pDQ105 plasmid carrying GFP tagged alpha 2 tubulin gene, was introduced to these two strains to label microtubules fluorescently. Mag-fura 2 AM prob which is spesific for ionized magnesium was used to show the effect of magnesium on GFP labelled mitotic microtubules and quantify the ionized magnesium simultaneously.Using the ratiometric imaging technique which is a very sensitive method for quantifying only free Mg2+, it has been confirmed that intracellular free magnesium is relatively lower in the double mutant than in control. Because of the mag-fura 2 probe calibration difficulties in Schz. pombe, intracellular free Mg2+ quantification couldn?t have been done. It was shown that GFP tagged microtubules were very sensitive to chemicals like Mag-fura 2 AM and microtubules were invisible in mag fura 2 loaded cells so our method needs for improvement to show microtubules and free magnesium simultaneously. On the other hand, at first we observed healthy interphase microtubules in the double mutant, however after first division, we observed short, reduced number of microtubule bundles and defects in microtubule organisation. After the second division, microtubules became invisible in the double mutant, although we observed the same for the control after the forth division. This made us think that the double mutant uptaked Mg2+ which is essential for the polymerisation of microtubules, either by passive transport in limited quantities or consumed from intracellular stores such as mitochondria. Also in logaritmic phase, the percentage of mitotic microtubules in the double mutant was %4, whereas in control strain was %17 and ~ %70 of the double mutant cells were long without septum and contained only one nuclei. This showed us, the double mutant cells were arrested in G2-M phase of the cell cycle. According to our findings, we think that magnesium deficiency may cause cell cycle arrest by preventing the formation of mitotic microtubules so effecting spindle assembly checkpoint. For a better understanding the effect of magnesium deficiency on mitotic microtubules and so on spindle checkpoint, gene expression profilling needs to be done using the double mutant as a model cell.