Doksorubisin kardiotoksisitesi üzerine Necrostatin-1`in koruyucu etkilerinin araştırılması

Abstract

Antineoplastik ilaç olan Doksorubisin'in klinik kullanımını kısıtlayan kardiotoksik yan etkisi bulunmaktadır. Bu etkiden, serbest radikallere bağlı gelişen direkt hücresel hasarın ve apoptozisin sorumlu olduğu gösterilmiştir. Son yıllarda bir başka programlı hücre ölüm yolağı olan nekroptozisin, hücre hasarı ile sonuçlanan çeşitli patolojik durumlarda rolü olduğu ortaya konulmuştur. Apoptozis ve nekroptozis oluşumunu tetikleyen başlangıç sinyalleri ortak olmakla beraber bu yollardan hangisinin aktive olacağı, bazı düzenleyici moleküllerin varlığı ve kaspaz enzimlerinin inhibisyonu ile belirlenmektedir.Bu çalışmada nekroptozis inhibitörü olan Necrostatin-1 (Nec-1)'in doksorubisin kardiotoksisitesi üzerine koruyucu etkisi araştırıldı. Ayrıca bu toksisitede rolü olduğu bilinen apoptozis yolağındaki caspase-3, bcl-2, bax, ve nox-2 gibi proteinlerin gen ekspresyon düzeylerinin Nec-1 ile nasıl etkilendiği incelendi.Bu amaçla kullanılan erkek Sprague-Dawley ratlar dört gruba ayrıldı. Gruplar; 1-Kontrol, 2-Dox: Doksorubisin (10 mg/kg, i,p, tek doz), 3-Necrostatin-1 (1,65 mg/kg, i.p 7gün)+Doksorubisin (tek doz 10 mg/kg, i.p), 4-sadece Necrostatin-1 (1,65 mg/kg, i.p, 7gün) olarak tanımlandı. Bütün gruplarda izole edilen kalpler Langendorff sisteminde perfüze edilerek, perfüzyon basıncı (PB), kalp atım hızı (KAH) ve sol ventrikül gelişen basıncı (LVDP) kaydedildi. Ayrıca kalbin kontraksiyon gücünü gösteren sol ventrikül kasılma hızı ve gevşeme hızını ifade eden LV(dP/dt)max ve LV(dP/dt)min kaydedildi. Tek doz Dox verilen grupta kontrol grubuna göre PB'nın istatistiksel olarak anlamlı şekilde arttığı (p<0.001); KAH, LVDP, LV(dP/dt)max ve LV(dP/dt)min değerlerinin ise anlamlı olarak azaldığı (p<0.001) görüldü. Buna karşılık Dox+Nec-1 grubunda ise Dox grubuna göre PB değerlerinin istatistiksel olarak anlamlı şekilde azaldığı (p<0.05); KAH, LVDP, LV(dP/dt)max ve LV(dP/dt)min değerlerinin ise anlamlı olarak arttığı (p<0.05) görüldü.Ayrıca oksidatif stresin göstergesi olarak Malondialdehit (MDA) konsantrasyonu ölçüldü ve Dox grubunda kontrol grubuna göre anlamlı olarak arttığı (p< 0.001), artan MDA değerinin Dox+Nec-1 grubunda Dox grubuna göre anlamlı olarak azaldığı gözlendi (p< 0.05). Histolojik deneyler sonucunda; kalp dokusunda Dox ile oluşan hasarın Nec-1 ile korunduğu gözlendi. Genetik analiz amacıyla dokularda caspase-3, bax, bcl-2, Nox-2'nin gen ekspresyon seviyeleri ölçüldüğünde; Bcl-2 seviyesi, Dox grubunda kontrol grubuna göre anlamlı olarak azalırken (p<0.001), Dox grubundaki azalmanın Dox+Nec-1 grubunda anlamlı olarak arttığı görüldü (p<0.001). Bax, casp-3 ve Nox-2 seviyeleri ise Dox grubunda kontrol grubuna göre anlamlı olarak artarken (p<0.001), Dox grubundaki artışın Dox+Nec-1 grubunda anlamlı olarak azaldığı görüldü (bax; p<0.05, casp-3 ve Nox-2: p<0.001).Sonuç olarak doksorubisin ile oluşan kardiotoksisitede Nec-1'in koruyucu etkilerinin olduğu görülmüştürAnahtar kelimeler: Doksorubisin, Kardiotoksisite, Nekroptozis, Necrostatin-1, Apoptozis, casp-3, bax, bcl-2, Nox-2

The clinical use of doxorubicin-an antineoplastic drug- is limited by its cardiotoxic side effects. It is shown that free oxgen radicals induced direct cellular injury and apoptosis are responsible for this toxic side effects. Recently another programmed cell death pathway, named necroptosis is also reported to be cause of cellular injury resulted in several pathological conditions. The upstream signaling elements that are triggered by death receptors are shared by both apoptotic and necroptotic pathways. Presence of some regulatory molecules and inhibition of caspases determine the route which will be activated. This study was performed to investigate the protective effects of necrostatin-1 (Nec-1) -an inhibitor of necrosis- on doxorubicin induced cardiotoxicity and also on expression levels of genes casp-3, bcl-2, bax, Nox-2 which are involved in apoptotic pathway.Male Sprague-Dawley rats were divided into four groups. Groups were defined as; 1:control, 2:Dox: Doxorubicin (a single dose of 10 mg/kg, i,p), 3:Doxorubicin (a single dose of 10 mg/kg, i,p) + Necrostatin-1 (1,65 mg/kg, i.p, for seven days), 4:only Nec-1 (1,65 mg/kg, i.p, 7 days) injected group. In all groups, isolated hearts were perfused by Langendorff system. Perfusion pressure (PP), left ventricular developed pressure (LVDP) and heart rate per minute (HR), LV( dP/dt)max and LV( dP/dt)min which shows systole and diastole rate were recorded. PP significantly increased (p<0.001) in Dox group according to control group; HR, LVDP, LV(dP/dt)max and LV (dP/dt)min significantly decreased (p<0.001). However in Dox+Nec-1 group according to Dox group; perfusion pressure significantly decreased (p<0.05). HR, LVDP, LV(dP/dt)max and LV(dP/dt)min values are significantly increased (p<0.05).As an indicator of oxidative stres malondialdehide's (MDA) levels were measured and in Dox group according to control group MDA values were significantly increased (p< 0.001), in Dox+Nec-1 group according to Dox group MDA values were significantly decreased (p< 0.05). In histological analysis; in cardiac tissue of rats Nec-1 reduced the cellular injury induced by doxorubicin. Expression level of bcl-2 was significantly decreased in Dox group according to control group (p<0.001), in Dox+Nec-1 group according to Dox group was significantly increased (p< 0.001). Expression levels of Bax, casp-3 and Nox-2 in Dox group according to control group were significantly increased (p<0.001), in Dox+Nec-1 group according to Dox group were significantly decreased (bax; p<0.05, casp-3 and Nox-2: p<0.001).It is concluded that Nec-1 has protective effects on cardiotoxicity induced by doxorubicin. Keywords: Doxorubicin, Cardiotoxicity, Necroptosis, Necrostatin-1, Apoptosis, casp-3, bax, bcl-2, Nox-2