In vitro transnöronal dejenerasyon mekanizmasında gen ifade değişiklikleri

Abstract

Sinir sisteminin travmatik ve dejeneratif hasarları başlangıçta sınırlı sayıda hücreyi etkilese de daha sonra hasarın yakın ve uzak bölgelere `Transnöronal Dejenerasyon (TND)` adı verilen bir meknizmayla yayıldığı bilinmektedir. Bu tez çalışması ile in vivo modellerle araştırılması kısıtlamalara maruz kalan bu konunun etkin bir in vitro model ile araştırılarak TND 'nun altında yatan moleküler mekanizmaların irdelenmesi amaçlanmıştır.Bu amaç doğrultusunda fare arka kök gangliyon (DRG)'larından yapılan primer nöron kültüründe sadece 10 nöron laserle aksotomi yapılmış ve her hasarlanan nöron kendisi ile komşu olan (herhangi bir müdaheleye maruz kalmayan) nöronun ölümüne sebep olmuştur. Bu nöronlar arasında oluşan transnöronal dejenerasyon mekanizmasının gen ifade değişiklikleri iki aşamalı kantitatif PCR uygulamaları ile analiz edilmiştir. Transnöronal dejenerasyonun gerçekleşmesi için kültürde uzayan aksonlar arasında fiziksel bir irtibatın olması gerektiği için hasarlanacak nöronlar dikkatle seçilmiştir. Hücre kaybına neden olan ölüm yolağı tam olarak bilinmediğinden hücre ölümü ile ilişkili 11 farklı gen (Bax, Bcl2, p53, Caspase 3, Fas, FasL, Atg5, Atg7, mTOR, Rıpk1, Rıpk3) ve hücre apoptozunda etkili olduğu daha önceden rapor edilen P2RX7 geni ile beraber referans gen olarak GAPDH seçilmiş ve toplamda bu 13 genin qRT-PCR ve immunositokimya teknikleri kullanılarak hem kantitatif hem de kaltitatif analizleri yapılmıştır.Bu tez çalışması ile TND mekanizmasında hasarlanan nöronlardan ortama yayılan pürin reseptörlerinin (P2RX7) miktarca arttığı gözlenmiştir. Bir başka sonuç ise mTOR geninin ifade analizlerinde gözlenen değişikliktir. mTOR gen ifadesi yapılan tüm deneylerde artış göstermiş ve istatistiksel analizlerde kontrol grubu ile aksotomi yapılan nörona komşu olan nöron arasında anlamlı sonuç vermiştir. Çalışmada araştırılan ve hücre ölüm çeşitleri ile ilişkili oldğu bilinen diğer genlerin ifade analizleri yapılan bazı deneylerde yüksek sonuç versede yapılan tekrarlı deneylerde istikrarlı bir artış gözlenmemiştir.

It is know that although degenerative and traumatic injuries of nervous system initially affect only a few cells, the damage may spread to close and remote locations and that a process called Transneuronal Degeneration (TND) may be in action in such situations.In this study, the molecular mechanism underlying TND had been proposed to investigate in vitro on account of this phenomenon was restricted to explore by in vivo models. In vivo models to study TND mechanism have limitations; in this study, which was designed to investigate this phenomenon in vitro .It was demonstrated that injury to only ten cells of cultured mouse dorsal root ganglion neurons (DRG) with a laser beam led to death of its neighboring neuron (Transneuronal Degeneration). According to this injured neuron and its neighboring neuron, two steps q RT-PCR technique was employed to observe any gene expression analyses.While it was known that physical contact of growing axons in culture was essential for the Transneuronal degeneration to occur, the neurons which will be axotomized are selected very carefully. In account of unknown for certain cell death pathway, 11 different genes (Bax, Bcl2, p53, Caspase 3, Fas, FasL, Atg5, Atg7, mTOR, Rıpk1, Rıpk3) that known to be involved in kinds of cell death, P2RX7 gene that had been reported to be related with apoptotic pathway and one Housekeeping gene (GAPDH) were used to obtain quantitative and qualitative analyses of the gene expression levels by performing qRT-PCR and Immunocytochemistry (ICC) techniques.In this study has demonstrated that pürin receptörs released after cell injury increase tendency of neurons to die in transneuronal mechanism. The other interesting conclusion was observed in assessment the amount of gene expression for mTOR. Statistical analyses of mTOR gene expression were showed that there is a significant correlation between neighboring neuron compared to control group. The expression of other genes that were used in this study increase provided in some experiment but it was not consistently observed.